游離DNA提取方法一般有TRizol方法、離心柱法、磁珠法。其中，Trizol方法與離心柱相比，提取效果相當(dāng)，但是因其對操作者帶來的毒性，現(xiàn)在越來越被棄用。磁珠法比較適合機(jī)器自動化提取，如果沒有核酸提取儀，只是使用磁力架配套提取，磁珠法的操作就比較麻煩且容易導(dǎo)致樣本交叉污染。另外，根據(jù)研究，磁珠法的核酸提取得率不如離心柱法。如果要提取的游離核酸的量比較低，選擇離心柱法。對于游離DNA含量較低的樣本或比較珍貴的樣本或樣本總數(shù)不是很多的實驗室，想到的是核酸提取方法應(yīng)是離心柱法。離心柱法游離DNA提取原理主要是樣本裂解后，DNA在高鹽條件下與硅膠膜結(jié)合，再在低鹽、高PH值時將DNA從硅膠膜上洗脫下來。面對各種品牌的離心柱法提取試劑盒，哪種才是適合的呢？目前國內(nèi)常用的離心柱法游離DNA提取試劑盒有國內(nèi)品牌Biog、品牌Q、國內(nèi)品牌T等。
我們以下就幾種游離DNA提取試劑盒進(jìn)行比較。一、有較高的提取得率。核酸提取得率的確定，常用的是使用紫外分光光度計的方法。但是，血清、血漿樣本中游離核酸含量較低，如果直接用紫外法檢測，得出的數(shù)值并不準(zhǔn)確，而且多次測量的結(jié)果會變異很大。關(guān)于提取得率，Qiagen的研究數(shù)據(jù)是1ml正常血漿樣本cfDNA得為7.35ng左右，但如果白細(xì)胞大量凋亡，血漿中的游離DNA量會有所增加，腫瘤病人血漿中的DNA會大幅增加。有些研究者提取血漿核酸后習(xí)慣于先用紫外檢測濃度，發(fā)現(xiàn)紫外檢測不出來或濃度很低時便認(rèn)為提取失敗，放棄后面進(jìn)一步的實驗，其實并不可取。我們可以把紫外讀數(shù)作為參考，但是不能作為判斷得率的標(biāo)準(zhǔn)，還是要做個PCR或熒光定量。根據(jù)Qiagen公司的實驗，血清血漿的量與提取的核酸量成正比。因而，如果要提高核酸得率，可通過增加血清或血漿的量來實現(xiàn)。一般地，做血漿或血清核酸提取，樣本量在1ml以上。如果1ml或更大量樣本得不到滿意的檢測結(jié)果，則應(yīng)及時考慮更換提取試劑盒。目前國內(nèi)常用的血漿核酸提取試劑有品牌Q、國內(nèi)品牌T、國產(chǎn)品牌Biog等，我們實驗室使用下來，Biog的核酸提取得率較高，1ml肺癌病人血漿樣本DNA得率在85ng左右，Q的得率在72ng左右，T的得率在63ng左右，基本上都能滿足下游PCR實驗的需求。當(dāng)然，如此低的濃度直接測OD值不太容易，如果使用Nanodrop2000c，其檢測下限為2ng/ul。如洗脫液為30ul，則需要1ml左右的血漿才能檢測出來。顯然，如果是健康人的血漿，1ml血漿的DNA濃度更低，紫外可能根本就檢測不出來。因而，血漿DNA提取完成以后，直接做PCR，紫外檢測的意義不大。